Expression und Mutagenese von VEP1-kodierten Progesteron-5β-Reduktasen aus pharmazeutisch interessanten Angiospermen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-11-23
Issue Year
2012
Authors
Bauer, Peter
Editor
Abstract

A main step in the biosynthesis of 5β-cardenolides is the stereo-specific reduction of the Δ4,5-C=C bond of the steroid precursor (progesterone), which introduces the characteristic cis-connection between the rings A/B. This reaction is catalysed by progesterone 5β-reductases (P5βR), which have been in the focus of this work. In order to find an explanation for the differences in the activities of the recombinant enzymes from the cardenolide-containing Digitalis lanata (rDlP5βR) and the cardenolid-free Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) for the reduction of progesterone and to change it by means of rational mutagenesis, an additional number of orthologous P5βR-cDNAs from cardenolide-accumulation and cardenolide-free species have been cloned (e.g. from A. belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N. tabacum). The primary aim of these experiments, however, was the functional expression of these enzymes. This was demonstrated for the cDNAs of E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum and M. Piperita. For the in vitro determination of the enzyme kinetics of the recombinant proteins, a photometric method has been developed. Using the data of all functionally expressed P5βR for homology modeling experiments, a number of seven highly-conserved amino acid residues could be deduced within the inner part of the putative substrate binding-sites of all proteins (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179, Met-215, Phe-343). Just two of these residues have been described to be catalytically important, formerly. In the DlP5βR all of these conserved residues have individually been substituted against alanine and the enzymatic activities of the muteins have been analysed. Especially the essential role of the Phe-153 residue for the enzymatic activity of the DlP5βR could be demonstrated. In combination with in silico methods Phe-153 and Phe-343 were identified to be important for the substrat-fixation in P5βR-like enzymes. Three „hot-spot“ positions (Tyr-156; Asn-205; Ser-248) for the site-directed mutagenesis (SDM) experiments - in order to increase the enzymatic activity of the DlP5βR - were found within its amino acid sequence. They were deduced by combining comparison of sequences and activities of the newly expressed enzymes („bioactivity guided“). By substituting the residues at two of these positions the catalytic activity of the rDlP5βR was highly increased (by a factor of 9; kcat/Km). This was due to an increased affinity of the binding-site for the substrate. Hence, the observed differences in the activity level of the rDlP5βR and the rAtP5βR could be explained. Other in silico theories were tested and could experimentally be disproved. A „full-length“ DlP5βR was cloned and functionally expressed. Subsequently, parts of the ORF were deleted by rational mutagenesis. With rational designed mutagenesis experiments the cosubstrate-specificity of the rDlP5βR was „switched“ from NADPH to NADH by the substitution of four amino acid residues (Ala-62, Arg-63; Arg-64; Asn-205) in order to gain an enzyme for the in vitro combination with other NADH-specific recombinant biosynthesis-enzymes.

Abstract

Ein wesentlicher Schritt in der 5β-Cardenolid-Biosynthese besteht in der stereo-selektiven Reduktion der Δ4,5-C=C-Doppelbindung der Steroidvorstufe (vermutlich Progesteron), da hierbei die charakteristische cis-Verknüpfung der Ringe A/B ins Molekül eingeführt wird. Die Reaktion wird katalysiert durch Progesteron 5β-Reduktasen (P5βR), die Gegenstand dieser Arbeit sind. Um die Aktivitätsunterschiede der rekombinanten Enzyme aus der Cardenolid-führenden Art Digitalis lanata (rDlP5βR) und der cardenolidfreien Art Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) hinsichtlich der Reduktion von Progesteron zu erklären und mit gezielter Mutagenese rational zu verändern, wurden zunächst weitere orthologe P5βR-cDNAs aus verschiedenen Cardenolid-akkumulierenden und Cardenolid-freien Spezies kloniert (u.a. aus A. belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N. tabacum). Im Vordergrund stand bei den Versuchen die funktionelle Expression dieser Enzyme in E. coli. Diese gelang u.a. bei den cDNAs aus E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum und M. piperita. Um die Enzymkinetik der rekombinanten Proteine in vitro zu bestimmen, wurde eine photometrische Messmethode für P5βR adaptiert. Der promiske Charakter der P5βR wurde weiter untermauert und dessen Bedeutung für die Biosynthese diskutiert. Mit Hilfe von erzeugten Struktur-Modellen der funktionell exprimierten P5βR konnten sieben Aminosäure-Reste identifiziert werden, die strukturell hoch konserviert im inneren Teil der putativen Substrat-Bindetasche aller Proteine vorliegen (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179, Met-215, Phe-343; Bauer et al., 2010). Von diesen Resten wurden bisher nur zwei als katalytisch bedeutsam beschrieben. Die konservierten Reste in der DlP5βR wurden einzeln durch Alanin ersetzt und die Aktivität der Muteine untersucht. Vor allem die essentielle Rolle von Phe-153 für die enzymatische Aktivität der DlP5βR konnte demonstriert werden. In Verbindung mit in silico-Überlegungen wurden Phe-153 und Phe-343 eine zentrale Bedeutung für die Substrat-Bindung bei den P5βR-artigen Proteinen zugesprochen. Für die rationale Mutagenese zur Steigerung der Enzymaktivität der rDlP5βR wurden drei Positionen innerhalb der Aminosäure-Sequenz als „hot-spots“ identifiziert (Tyr-156; Asn-205; Ser-248). Dies geschah über eine Kombination aus Sequenz- und Aktivitätsvergleichen der neu exprimierten Enzyme („bioactivity guided“). Durch die einfache Mutagenese von zwei dieser Positionen konnte die katalytische Aktivität der DlP5βR stark verbessert werden (bis Faktor 9, bezogen auf kcat/Km). Dies wurde zurückgeführt auf eine größere Affinität der Bindetasche zum Substrat. Der Aktivitätsunterschied der rDlP5βR und der rAtP5βR konnte somit erklärt werden. Andere publizierte in silico-Theorien wurden überprüft und konnten experimentell widerlegt werden. Eine „full-length“ DlP5βR wurde kloniert und funktionell exprimiert. Das Gen wurde über Deletionsmutagenese rational verkürzt. Über einen rationalen Mutagenese-Ansatz konnte zusätzlich durch die Substitution von vier Aminosäuren (Ala-62, Arg-63; Arg-64; Asn-205) die Cosubstrat-Spezifität der rDlP5βR von NADPH auf NADH (ohne Verlust an Enzymaktivität) geändert werden, um ein Enzym für die Kombination mit anderen NADH-spezifischen, rekombinanten Biosynthese-Enzymen zu besitzen.

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